Хроматография
Множество открытий прошедшего века обязаны русскому ученому Михаилу Цвету и его методу хроматографического анализа. Большое число выдающихся исследователей обязано ему своими успехами, а многие и Нобелевскими премиями!
«…Без работ Майкла Цвета нам, всем „пигментщикам“, делать было бы нечего…» — вот мнение одного известного английского ученого.
Михаил Семенович Цвет (1872–1919) — сын итальянки и русского интеллигента. Он родился в Италии в городе Асти, неподалеку от Турина. В 1891 году Михаил окончил Женевскую гимназию и поступил на физико-математический факультет Женевского университета. Представив диссертацию «Исследование физиологии клетки. Материалы к познанию движения протоплазмы, плазматических мембран и хлоропластов» Цвет в октябре 1896 года получил диплом доктора естественных наук. В декабре того же года он приезжает в Петербург.
Михаил не знал, что ученая степень Женевского университета не признается в России. Поэтому ему пришлось работать у известного ботаника Андрея Сергеевича Фаминцина, также изучавшего хлорофилл, можно сказать, на птичьих правах. В Петербурге Цвет познакомился с другими выдающимися ботаниками и физиологами растений: И.П. Бородиным, М.С. Ворониным, А.Н. Бекетовым. Это было блестящее общество оригинальных, богатых идеями мыслителей и умелых экспериментаторов. Цвет продолжил свои исследования хлоропластов, готовясь в то же время к новым магистерским экзаменам и к защите диссертации. Экзамены он сдал в 1899 году, а магистерскую диссертацию он защитил в Казанском университете 23 сентября 1901 года.
С ноября 1901 года Цвет работает на должности ассистента кафедры анатомии и физиологии растений в Варшавском университете. На XI Съезде естествоиспытателей и врачей Михаил Семенович сделал доклад «Методы и задачи физиологического исследования хлорофилла», в котором впервые сообщил о методе адсорбционной хроматографии.
Михаил Семенович долгое время решал задачу разделения пигментов зеленого листа, а они очень близки по свойствам. К тому же в листьях присутствуют и другие, очень яркие, пигменты — каротиноиды. Именно благодаря каротиноидам и по осени появляются желтые, оранжевые, багровые листья. Однако пока хлорофиллы не разрушатся, отделить их от каротиноидов было почти невозможно.
Как замечает Ю.Г. Чирков, «видимо, открытие Цвета явилось реакцией на существующие тогда грубые и убийственные для пигментов методы их разделения. Вот один из приемов.
Сначала добывали спиртовую вытяжку хлорофилла, затем ее три часа кипя гили с добавлением в раствор крепкой щелочи (едкого калия). В результате хлорофилл разлагается на составные части — зеленый и желтый пигменты.
Но ведь в процессе изготовления этого зелья (почти алхимические манипуляции) природный хлорофилл мог разрушиться. И тогда исследователь имел бы дело с кусками пигментов, а то и с продуктами их химического превращения».
О том, как свершилось великое открытие, пишет С.Э. Шноль: «Он взял стеклянную трубку, наполнил ее порошком мела и на верхний слой налил немного спиртового экстракта листьев Экстракт был буро-зеленого цвета, и такого же цвета стал верхний слой меловой колонки. А затем М.С. начал по каплям лить сверху в трубку с мелом чистый спирт. Капля за каплей очередная порция растворителя элюировала пигменты с крупинок мела, которые перемещались вниз по трубке. Там свежие крупинки мела адсорбировали пигменты и в свою очередь отдавали их новым порциям растворителя. В силу несколько разной прочности адсорбции (легкости элюции) увлекаемые подвижным растворителем разные пигменты двигались по меловой колонке с разной скоростью и образовывали однородные окрашенные полосы чистых веществ в столбике мела. Это было прекрасно. Ярко-зеленая полоса, полоса чуть желтее зеленого — это два вида хлорофиллов — и яркая желто-оранжевая полоса каротиноидов. М.С. назвал эту картину хроматограммой».
В 1903 году Михаил Семенович Цвет прочел доклад «О новой категории адсорбционных явлений и о применении их к биохимическому анализу». Здесь он впервые обстоятельно излагает принцип своего метода адсорбционного анализа.
«Цвет показал, — пишет Чирков, — что при пропускании растворенных в жидкости растительных пигментов через слой бесцветного пористого сорбента отдельные пигменты располагаются в виде окрашенных зон — каждый пигмент имеет собственный цвет или хотя бы оттенок. Порошок сорбента (это может быть мел, сахарная пудра…) адсорбирует (поверхностно поглощает: латинское adsorbere значит „глотать“) разные пигменты с неодинаковой силой: одни могут „проскочить“ с током раствора дальше, другие окажутся задержанными ближе. Полученный таким образом послойно окрашенный столбик сорбента Цвет назвал хроматограммой, а метод — хроматографией».
Так была решена казавшаяся неразрешимой задача. Метод оказался гениально прост. Он совсем не похож на громоздкие, требовавшие большого числа реактивов сложные процедуры, применяемые до этого.
Может, эта простота стала причиной того, что большая часть современников или не восприняла это удивительное открытие, или, что еще печальнее, резко восстала против его автора.
Но время все расставило на свои места. Цвет изобрел хроматографию для исследований хлорофилла. Он впервые выделил вещество, которое назвал хлорофиллом альфа и хлорофиллом бета. Он оказался пригодным для исследований не только пигментов, но и бесцветных, неокрашенных смесей — белков, углеводов. К шестидесятым годам двадцатого века хроматографии было посвящено уже несколько тысяч исследований. Хроматография стала универсальным методом.
«…Принцип хроматографического разделения веществ, открытый М. Цветом, лежит в основе множества разнообразных методов хроматографического анализа. Без его использования было бы невозможно большинство достижений в науке и технике XX века…
В основе всего этого — одна общая идея. Она проста. Это, в сущности, идея геометрической прогрессии. Пусть имеются два вещества очень близкие по всем своим свойствам. Ни осаждением, ни экстракцией, ни адсорбцией не удается разделить их в заметной степени. Пусть одно вещество адсорбируется на поверхности, например, карбоната кальция (т. е. менее 1 процента).
Иными словами, его содержание на адсорбенте составит 0,99 от содержания другого. Обработаем адсорбент каким-либо растворителем так, чтобы произошли десорбция (отсоединение) и элюция (смывание) обоих веществ и оба они перешли бы с адсорбента в растворитель, и перенесем этот получившийся раствор на свежую порцию адсорбента. Тогда доля первого вещества на поверхности адсорбента снова будет равна 0,99 от содержания второго, т. е. адсорбируется часть, равная 0,99 х 0,99=0,98 от исходного количества. Еще раз проведем элюцию и снова адсорбцию — теперь доля первого вещества составит 0,98 х 0,99 = 0,97 от содержания второго. Чтобы содержание первого вещества на очередной порции адсорбента составило всего 1 процент от содержания второго, потребуется повторить цикл адсорбции-элюции около 200 раз…
Идея многократной переадсорбции для разделения веществ может быть модифицирована в многократное перераспределение смеси веществ в системе несмешивающихся растворителей. Это — основа распределительной хроматографии. Та же идея лежит в основе современных методов электрофореза, когда смесь веществ движется с разной скоростью по различным адсорбентам в электрическом поле.
Тот же принцип используется при разделении изотопов с помощью диффузии через множество пористых перегородок».
Принцип хроматографического распределения веществ, открытый Цветом, используется в различных областях человеческой деятельности. В частности, его применяют для выделения и очистки антибиотиков в медицине и для разделения изотопов при производстве ядерного топлива.
